生命的產生是一個神奇的過程，經歷了受精卵分裂、胚胎發育和胎兒生長。其間伴隨著全身器官的發育和成熟，以及成百上千種細胞的擴增和分化，這決定了生物體的后期功能。

近日，美國洛克菲勒大學助理教授曹俊越因其在高通量單細胞測序技術以及發育生物學方面的成就，成為《科學》和SciLifeLab頒發的2020年度青年科學家獎特等獎全球唯一得主。11月20日，《科學》刊登了其獲獎短文，描述了有助于研究生命產生奧秘的4項高通量單細胞測序技術。

之前，11月13日，《科學》還刊登了洛克菲勒大學、華盛頓大學醫學院、羅特曼·巴蒂研究所等機構研究人員利用這些新技術創造的兩個細胞圖譜，以追蹤人類細胞類型和組織發育過程中的基因表達和染色質可及性。

從失敗中完善

“細胞是生物體結構和功能的最基本單位，為了解生命的產生過程，我們需要系統性地分析人體每一種細胞種類及其在發育過程中的動態變化和分子機理。”曹俊越在接受《中國科學報》專訪時表示，而傳統手段受限于檢測的靈敏性，無法對人體的幾百種細胞進行全面檢測和比較。

近幾年，單細胞測序技術，尤其是單細胞轉錄組測序技術，通過同時檢測單細胞幾萬種基因的表達，精確定義了細胞的分子學狀態，從而被廣泛應用于檢測新的細胞種類，以及研究發育和疾病對細胞狀態的影響。但目前的單細胞測序技術只能檢測幾千個細胞，遠遠低于正常人體組織包含的細胞數目(百萬級)，同時耗材費用昂貴，因此無法全面檢測人體組織中的細胞種類和變化。

為了解決這一問題，在華盛頓大學Jay Shendure實驗室4年讀博研究期間，曹俊越研發了高通量單細胞轉錄組測序技術(sci-RNA-seq)等4項高通量單細胞測序技術。

“相對于傳統的生物學領域，新技術研發的困難主要在于要發明自然界中不存在的新事物，因此這一過程風險很高，往往要經歷很多失敗和挫折。”曹俊越回憶道，在研發sci-RNA-seq的最初過程中，他用兩年時間反復嘗試了262種實驗條件才摸索出最初的技術雛形。

之后，研究人員又實驗了超過1718種條件組合來優化sci-RNA-seq，從而使這項技術可以真正用來分析上百萬個單細胞的基因表達圖譜。“大部分的實驗都沒有成功，但是沒有這些失敗和汗水，也就沒有最終完善的技術。”曹俊越說。

終于，基于組合標記的sci-RNA-seq實現了不依賴于細胞分離的單細胞基因表達檢測。

4項技術

sci-RNA-seq被用于檢測超過5萬個線蟲單細胞的轉錄組測序，從而構建了世界首個生物個體水平的單細胞轉錄組圖譜。研究人員繪制了27個主要細胞種類的基因表達圖譜，并監測到各種罕見的神經細胞種類。這些數據不僅在線蟲研究領域具有重大意義，而且為構建其他生物物種的細胞轉錄組圖譜提供了模板。

相對于線蟲，哺乳動物包括人的發育過程涉及更加多樣的細胞類型和復雜的分子程序。曹俊越等人研發了另一項高通量單細胞測序技術：sci-RNA-seq3。該技術可以同時檢測幾百萬個單細胞轉錄圖譜，其費用是以往技術的1/10。同時這項技術不依賴于特殊的儀器設備，可以廣泛應用于世界大部分研究機構。

研究人員首先用這項技術對小鼠主要器官的發育階段(胚胎期9.5天至13.5天)進行高精度單細胞水平的系統性研究。他們一共檢測到200萬個單細胞組成的500多個細胞種類，并系統性繪制了形成各種器官的細胞分化路徑以及每個路徑中幾萬種基因的表達變化。

針對目前大部分單細胞測序技術只能檢測基因表達而忽略其他分子水平變化的局限，曹俊越等人又研發了高通量單細胞雙圖譜測序技術sci-CAR，可以同時檢測上萬個單細胞的轉錄組和染色質可及性數據，并成功構建首個哺乳動物器官水平(腎臟)的單細胞雙圖譜。

此外，目前的單細胞測序技術依然局限于描述細胞的靜態而忽略了動態變化。延時顯微鏡可以通過實驗測量細胞的動態轉變，但僅限于研究培養皿中少數細胞的少數標記基因，因此可能不足以解釋許多生物系統的復雜性。為此，曹俊越發明了sci-fate技術，用于研究大量單細胞在轉錄組水平的基因表達動態。這項技術通過結合sci-RNA-seq和4-硫尿苷(4sU)標記新生mRNA技術，可以大規模分析幾千到幾百萬個單細胞轉錄組。

2017年至2020年，上述幾項成果發表于《自然》《科學》和《自然—生物技術》。

兩個圖譜

近日，研究人員使用這些技術，繪制了兩份新的圖譜：15種胎兒組織單個細胞內的基因表達圖譜和細胞內單個基因染色質可及性圖譜。

基因表達是細胞使用儲存在DNA中的指令指導蛋白質合成的過程。而這些蛋白質又決定了細胞的結構和功能。基因表達圖譜繪制了不同類型細胞生長發育過程中發生基因表達的時間和地點。

華盛頓大學醫學院基因組學教授Jay Shendure告訴記者：“這一領域的總體目標是在盡可能大的范圍內，以盡可能高的分辨率描繪人體遺傳程序。”

為了繪制圖譜，研究人員使用sci-RNA-seq3技術，對15種胎兒組織的基因表達進行了分析。科學家分析了400多萬個單細胞，確定了77種主要細胞類型和大約650個細胞亞型。研究發現了一些新的細胞種類，并綜合分析了主要細胞類型(包括血液、內皮細胞和上皮細胞)的器官特異性。

他們將人類胎兒單細胞圖譜和小鼠胚胎細胞圖譜整合在一起，并構建了細胞和基因從胚胎到胎兒發育的動態軌跡。華盛頓大學醫學院基因組學副教授Cole Trapnell表示：“把這些數據和之前發表的數據結合起來，可以直接描繪出所有主要細胞類型的細胞發育路徑。”

第二份DNA可及性圖譜繪制了一種名為染色質的物質，這種物質允許DNA緊密地排列在細胞核內。“研究染色質能讓你了解細胞的調控‘語法’。”亞利桑那大學助理教授Darren Cusanovich說。

在這項研究中，科學家在15種胎兒組織的約100萬個位點上生成了近80萬個單細胞染色質可及性圖譜。他們分析了哪些蛋白質可能與每個細胞中的DNA位點相互作用，以及這些相互作用如何解釋細胞類型。這種分析定義了基因組內發育的控制開關。他們還確定了染色質易接近的位點，這些位點可能與疾病有關。

“每一項新技術都是一扇新的窗戶，使我們可以領略這個世界獨一無二的風景。通過研發更先進的技術，我們可以不斷超越前人和自己的局限性，同時用這些新技術探索生命的奧秘和美麗。”曹俊越說。(記者 唐鳳)

關鍵詞： 單細胞